E' STATO VERAMENTE LUC MONTAIGNER A SCOPRIRE L'HIV?

"RIBADISCO, NOI NON LO ABBIAMO ISOLATO!"

Rivista Continuum 1997 vol 5, numero 2

Questa intervista farà parte di un libro che verrà pubblicato quest'anno titolato “Una conversazione sull'AIDS col Professore Montaigner” dove lo scienziato francese riferisce all'autore Djamel Tahi diversi aspetti della ricerca sull'AIDS.

Nel presente articolo le risposte di Luc Montaigner sono state numerate per agevolare il riferimento per l'analisi.

 

D.T.: Un gruppo di scienziati dell'Australia afferma che nessuno è finora riuscito ad isolare il virus dell’AIDS, cioè, l’HIV. Secondo loro i criteri per l'isolamento dei retrovirus non sono stati rispettati con cura per quanto riguarda l’HIV. Questi criteri sono: coltura in vitro, purificazione del materiale mediante ultracentrifugazione, micrografie al microscopio elettronico (EM) del materiale che compare in bande alla densità dei retrovirus, caratterizzazione di queste particelle, e conferma della infettività delle particelle.

L.M.: No, ciò non è quello che viene ritenuto (scientificamente) un isolamento. Abbiamo eseguito l'isolamento perché noi "abbiamo trasmesso" il virus, abbiamo fatto una coltura del virus. Ad esempio Gallo disse: "Loro non hanno isolato il virus... e noi (Gallo e la sua equipe) l’abbiamo fatto emergere in abbondanza in una linea cellulare immortale." Comunque prima di farlo emergere in linee cellulari immortali, l’abbiamo fatto emergere in colture di linfociti normali provenienti da un donatore di sangue. Questo è il criterio principale. Avevamo un qualcosa che potevamo trasmettere in serie, che potevamo conservare. Ed era anche stato caratterizzato come retrovirus non soltanto  per le sue proprietà visibili, ma anche per quelle biochimiche, cioè, l’attività di transcriptasi inversa (RT), che è veramente specifica dei retrovirus. Abbiamo anche avuto le reazioni degli anticorpi contro certe proteine, che probabilmente erano proteine interne. Lo dico probabilmente  per analogia con la conoscenza di altri retrovirus. Non avremmo potuto isolare questo retrovirus senza la conoscenza di altri retrovirus, ciò è ovvio. Comunque credo che abbiamo totalmente soddisfatto i criteri di isolamento.       1 

D.T.: Torniamo al protocollo di isolamento dei retrovirus che è: coltura in vitro, purificazione alla densità dei retrovirus, micrografie EM del materiale alla densità dei retrovirus, caratterizzazione delle particelle, verifica della capacità infettiva delle particelle. Sono state eseguite tutte queste fasi per l'isolamento dell'HIV? Vorrei aggiungere che prendendo in considerazione diverse referenze di articoli scientifici pubblicati che sono stati menzionati dal gruppo di ricerca australiano si vede anche che l’RT non è specifica dei retrovirus. Inoltre, avrei il piacere di domandarLe, è vero che il vostro lavoro per rilevare l’RT non è stato eseguito sul materiale purificato?

L.M.: Credo che abbiamo pubblicato su Science (a maggio del 1983) un gradiente che mette in mostra che l’RT aveva per la precisione una densità di 1,16. Quindi avevamo un massimo, che era RT. Di conseguenza abbiamo soddisfatto questo criterio per la purificazione. Comunque è difficile trasmetterlo in serie perché quando si mette del materiale che è in via di purificazione su un gradiente, occorre sapere che i retrovirus sono molto fragili, quindi si rompono a vicenda ed in questo modo perdono assai il loro potere infettivo. Penso che comunque siamo riusciti a conservare un po' del loro potere infettivo. Allora non era tanto facile farlo quanto oggi, perché le quantità di virus erano non di meno molto basse. All'inizio ci siamo imbattuti su un virus che non uccideva le cellule. Il virus proveniva da un paziente asintomatico e di conseguenza è stato classificato tra i virus che non formano sincizi e non citopatogenici che adoperano il co-ricettore ccr5. Questo è stato il primo virus [dell’omosessuale chiamato] BRU. Ne avevamo molto poco, e non potevamo trasmetterlo su una linea di cellule immortali. Abbiamo provato a farlo per diversi mesi, ma non c'è l'abbiamo fatta. Mentre invece col secondo ceppo c'è l'abbiamo fatta molto facilmente. Tuttavia lì c’è il problema abbastanza misterioso della contaminazione di quella seconda discendenza ad opera della prima. Quello era stato chiamato LAI  [HIV].        2

D.T.: Perché le micrografie EM da voi pubblicate provengono da un coltura cellulare in vitro e non dal materiale purificato?

L.M.: C'era talmente poca produzione di virus che era impossibile vedere cosa poteva esserci nel concentrato di virus proveniente da un gradiente. Non c'era una quantità sufficiente di virus per far questo. Certamente lo abbiamo cercato, ma anche se lo cercavamo fin dall’inizio nei tessuti e anche nella biopsia, abbiamo visto alcune particelle che però non avevano la morfologia tipica dei retrovirus. Erano molto diverse, relativamente differenti. Di conseguenza abbiamo impiegato diverse ore nella coltura in vitro per trovare le prime micrografie. E' stato uno sforzo gigantesco! E' facile criticare tutto questo a posteriori. Ciò che non avevamo, e l’ho sempre riconosciuto, è la conferma  del fatto che fosse veramente la causa dell'AIDS o no.             3

D.T.: Come è possibile,senza avere a disposizione le micrografie al microscopio elettronico (EM) della purificazione, sapere se queste particelle sono virali e se appartengono ad un retrovirus, addirittura ad un retrovirus specifico?

L.M.: Beh, c'erano le micrografie della gemmazione. Abbiamo pubblicato immagini della gemmazione, che sono caratteristiche dei retrovirus.  Detto ciò, non potevamo affermare che si trattava veramente di un retrovirus basandoci solamente sulla morfologia.  Ad esempio, uno specialista francese delle micrografie all’EM dei retrovirus mi attaccò pubblicamente dicendo: "Questo non è un retrovirus, ma un arenavirus". Perché ci sono altre famiglie di virus che fuoriescono anch’esse dalla membrana cellulare e che presentano punte nella loro superficie, ecc.       4

D.T.: Perché esiste questa confusione? Le micrografie EM non mostrano chiaramente un retrovirus?

L.M.: In quel momento i retrovirus meglio conosciuti erano quelli di tipo C, che erano molto tipici. Il retrovirus di cui stiamo parlando non era del tipo C ed i lentivirus erano poco conosciuti. Io personalmente l’ho riconosciuto nella biblioteca guardando micrografie del virus dell'anemia infettiva equina, e dopo quelle del virus visna. Ma ribadisco, non è stata solo la morfologia e la gemmazione, c'era RT... è stato l'insieme di queste proprietà ciò che mi fece affermare che si trattava di un retrovirus.     5

D.T.: Riguardo l’RT, la si trova nella coltura in vitro. Quindi se si trovano particelle retrovirali significa che è avvenuta la purificazione. Comunque a questa densità ci sono molti altri elementi, tra cui quelli che vengono chiamati "simili ai virus".

L.M.: Certo, certo. In altre parole, non è solo una proprietà ma l'insieme delle proprietà ciò che ci fece affermare che si trattava di un retrovirus appartenente alla famiglia dei lentivirus. Presa isolatamente, ciascuna delle proprietà non è veramente specifica, è invece il loro insieme quel che conta. Quindi avevamo il gradiente di densità, l’RT, le micrografie della gemmazione e l’analogia col virus visna. Queste sono le quattro caratteristiche.        6

D.T.: Ma come fanno tutti questi elementi a dimostrare che si tratta di un nuovo retrovirus? Alcuni di questi elementi potrebbero appartenere ad altre cose, a delle particelle "simili ai virus" ad esempio...?

L.M.: Certo, e addirittura abbiamo retrovirus endogeni che delle volte esprimono particelle, ma che sono di origine endogena e quindi non svolgono alcun ruolo patologico, in ogni caso non nell'AIDS.            7

D.T.: Allora come si riesce a fare la distinzione?

L.M.: Perché siamo riusciti a “trasmettere” il virus. Abbiamo trasmesso l'attività RT su nuovi linfociti. Abbiamo ottenuto un massimo di attività di replicazione. Abbiamo seguito la traccia del virus. L'insieme delle proprietà ci ha fatto affermare che si trattava di un retrovirus. E perché è nuovo? Ecco la prima domanda che ci è stata sollevata dalla rivista Nature: "Non si tratta per caso di una contaminazione da laboratorio? Si tratta per caso di un retrovirus di un topo o di un retrovirus animale?". A ciò potevamo dire di no! Perché avevamo dimostrato che il paziente aveva anticorpi contro una proteina del proprio virus. L'insieme ha una logica perfetta! Comunque è importante prenderlo come un insieme. Se si prende ciascuna proprietà in maniera indipendente, si vede che non sono specifiche. E' l'insieme che rende la specificità.         8

D.T.: Comunque Lei ha osservato particelle che sembravano dei retrovirus alla densità dei retrovirus ? Ha osservato un nuovo retrovirus?

L.M.: Ad una densità di 1,15, 1,16 avevamo un massimo di attività RT, che è l'enzima caratteristico dei retrovirus.      9

D.T.: Ma potrebbe essere stata un'altra cosa?

L.M.: No... secondo me era molto chiaro [che non si trattava di un’altra cosa]. Così com’era, non sarebbe stato possibile che fosse stato nient'altro che un retrovirus. Visto che l'enzima caratterizzato biochimicamente dal [mio collega] F. Barre-Sinoussi aveva bisogno di magnesio, un po’ come l’HTLV altrove. Aveva bisogno della matrice, la sagoma, anche del primer che era totalmente caratteristico di una RT. Non c'erano dei dubbi al riguardo. A settembre del 1983 a Cold Spring Harbour, Gallo mi chiese se ero sicuro che si trattava di una RT. Lo sapevo, perché F. Barre-Sinoussi aveva fatto dei controlli. Non si trattava di una semplice polimerasi cellulare, ma di una RT. Funzionava soltanto con primer di RNA,  e faceva DNA. Eravamo sicuri di quello.       10

D.T.: Lei ha seguito la stessa procedura e ha trovato le stesse difficoltà nei confronti de gli altri retrovirus che ha trovato lungo la sua carriera?

L.M.: Le direi che per quanto riguarda l'HIV è un processo facile, in confronto con gli ostacoli che si trovano con gli altri [retrovirus]... dovuto al fatto che il virus non compare, o addirittura perché l'isolamento è alquanto sporadico, ce la facciamo una volta su cinque tentativi. Sto parlando della ricerca normale che avviene su altre malattie. Possiamo citare il virus della sclerosi multipla del Professore Peron. Lui mi ha fatto vedere il suo lavoro una decina di anni fa e ci ha messo dieci anni circa per trovare alla fine una sequenza genetica che è molto vicina ad un virus endogeno. Lo capisce ... è molto difficile. Visto che non è riuscito a trasmettere il virus, non è nemmeno riuscito a farlo comparire su una coltura in vitro. Ma l'HIV spunta come l’erbaccia. Il ceppo LAI [HIV], ad esempio, spunta come l’erbaccia. Per questo motivo ha contaminato gli altri.     11

D.T.: Con cosa Lei ha coltivato i linfociti dei suoi pazienti? Con la linea cellulare H9?

L.M.: No, perché non ha funzionato in assoluto con l'H9. Abbiamo adoperato molte linee cellulari ed i linfociti Tambon è stata l'unica linea cellulare che siamo stati in grado di coltivare.          12

D.T.: Comunque adoperando questo tipo di elementi è possibile introdurre altre cose in grado di indurre una RT, e proteine, ecc...

L.M.: Sono completamente d'accordo. E' stato il motivo per cui alla fine non eravamo molto interessati ad adoperare linee cellulari immortali. Per coltivare il virus in serie, grosso modo andava bene. Ma non per caratterizzarlo, perché sapevamo che avremmo introdotto altre cose. Ci sono linee cellulari MT che sono state trovate dai giapponesi (MT2, MT4) che replicano l'HIV molto bene e che vengono contemporaneamente trasformate dal HTLV. Quindi abbiamo un misto di HIV e HTLV. E' un vero miscuglio.      13

D.T.: Oltretutto, non è possibile che i pazienti siano stati infettati da altri agenti infettivi?

L.M.: Potrebbero esserci stati dei micoplasmi... potrebbero esserci stati un sacco di cose. Comunque per fortuna avevamo avuto un’esperienza negativa con i virus associati ai tumori e ciò ci ha aiutato, perché ci avevamo già imbattuto su tutti questi problemi. Ad esempio, un giorno ho avuto un massimo di attività di RT molto debole, che mi è stato consegnato da Barre-Sinoussi, con una densità un po' più alta, cioè, di 1,19. Ma l’ho controllata! Si trattava di un micoplasma, ma non di un retrovirus.      14

D.T.: Col materiale purificato alla densità tipica dei retrovirus, come è possibile distinguere tra ciò che è virale e ciò che non lo è? Perché a questa densità ci sono un sacco di altre cose, ivi comprese delle particelle "simili ai virus", frammenti cellulari...

L.M.: Certo, ed è per questo motivo che risulta più facile lavorare con la coltura cellulare in quanto si vedono le fasi della produzione dei virus. Abbiamo la gemmazione. Charles Dauget (uno specialista in EM) ha piuttosto osservato direttamente le cellule. Certamente guardò il plasma, il concentrato, ecc ... ma non ha visto niente di importante. Visto che se viene fatto un concentrato c'è bisogno di ottenere una sezione sottile (per guardare un virus mediante l'EM), e per ottenere una sezione sottile bisogna avere un concentrato che misuri almeno quanto la testa di un ago. Per riuscire a far questo occorre avere enormi quantità di virus. Tuttavia, si riescono ad ottenere sezioni sottili di cellule molto facilmente ed è in queste sezioni sottili dove Charles Dauget trovò i retrovirus, nelle diverse fasi della gemmazione.           15

D.T.: Quando si guardano le micrografie al microscopio elettronico che sono state pubblicate, essendo un retrovirologo, è chiaro per Lei che si tratta di un retrovirus, di un nuovo retrovirus?

L.M.: No, a quel punto non lo si può affermare. Le prime micrografie della gemmazione potevano riferirsi ad un tipo di virus C, ma ciò non si riesce a distinguere.    16

D.T.: Potrebbe trattarsi di qualcos'altro anzichè di un retrovirus?

L.M.: No ... beh, dopotutto, sì ... potrebbe trattarsi di un altro virus, in fase di gemmazione. Comunque c'è un... abbiamo un atlante. E' l'esperienza che ci fa capire ciò che è un retrovirus e cio’ che non è. Lo si può distinguere dalla morfologia, ma bisogna avere una certa esperienza.         17

D.T.: Perché non adoperare la  purificazione per fare la distinzione?

L.M.: Ribadisco che non abbiamo purificato. Abbiamo purificato per caratterizzare la densità dell’RT, che era solidamente quella di un retrovirus.  Ma non siamo arrivati al massimo... oppure non ha funzionato... perché se si purifica, si danneggia. Quindi per quanto riguarda le particelle infettive, è meglio non toccarle molto. Di conseguenza si preleva semplicemente il supernatante della coltura dei linfociti che ha prodotto il virus e lo si mette in piccole quantità su alcune nuove colture di linfociti. Ne consegue che si trasmette il retrovirus in serie e si ritroveranno sempre le stesse caratteristiche,  aumentando la produzione ogni volta che avviene la trasmissione.      18

D.T.: Quindi lo stadio di purificazione non è necessario?

L.M.: No, no, non è necessario. Ciò che è fondamentale è trasmettere il virus. Il problema che Peron ha avuto col virus della sclerosi multipla fu dovuto al fatto che lui non riusciva a trasmettere il virus da una coltura all'altra. E' questo il problema. E' riuscito un po' a farlo, ma non sufficientemente per caratterizzarlo. Oggi caratterizzare significa soprattutto farlo a livello molecolare. Se si desidera, la procedura va fatta più velocemente. Quindi per farlo bisogna partire da una sequenza di DNA, clonare questo DNA, amplificarlo, sequenziarlo, ecc...Quindi abbiamo il DNA, la sequenza del DNA che ci dice se si tratta veramente di un retrovirus. Si conosce la struttura tipica dei retrovirus, tutti i retrovirus hanno una struttura genomica tipica in rapporto ad un tale gene che è caratteristico.   19

D.T.: Quindi lo stadio di purificazione non è obbligatorio per l'isolamento dei retrovirus? Si possono isolare i retrovirus senza purificare?

L.M.: Certo... non è obbligatorio trasmettere materiale puro. Sarebbe meglio, ma esiste il problema che il materiale viene danneggiato e diminuisce la proprietà infettiva dei retrovirus.       20

D.T.: Senza passare attraverso questo stadio di purificazione, non esiste per caso il rischio di confondere le proteine che vengono identificate e anche l'RT, che potrebbe provenire da qualcos'altro?

L.M.: No,... dopotutto ribadisco che se abbiamo un massimo di attività di RT ad una densità di 1,15, 1,16 ci sono 999 possibilità su 1.000 che si tratti di un retrovirus. Ma potrebbe trattarsi di un retrovirus di origine diversa. Ribadisco, ci sono alcuni retrovirus endogeni, cioè, pseudo particelle che possono venir emesse dalle cellule, ma comunque, provengono dalla zona del genoma che fornisce i retrovirus. I retrovirus endogeni vengono ereditati e permangono nella cellula per un molto lungo periodo di tempo. Comunque alla fine, per avere la prova - perché le cose evolvono alla pari della biologia molecolare consentendo oggi una caratterizzazione ancora più facile - bisogna passare molto velocemente al clonaggio.  Codesto è stato fatto molto velocemente, sia da Gallo che da noi stessi. Clonazione e sequenziazione, è lì dove abbiamo la caratterizzazione completa. Ma ribadisco, la prima caratterizzazione è quella dell'appartenenza o no alla famiglia dei lentivirus, la densità, la gemmazione ecc.... le proprietà biologiche, l'associazione con le cellule T4. Tutto ciò fa parte della caratterizzazione, e siamo stati noi a portarla avanti.     21

D.T.: Ma si arriva ad un punto dove bisogna fare la caratterizzazione del virus. Ciò significa: quali sono le proteine di cui è composto?

L.M.: Certo. Quindi, allora l'analisi delle proteine del virus richiede produzione massiccia e purificazione. Bisogna farlo. Ma a questo punto dovrei dire che c’è stato un fallimento parziale. J. C. Chermann era responsabile di far questo, almeno per quanto riguarda le proteine interne, ma ha avuto delle difficoltà per produrre il virus, e quindi non ha funzionato. Ma questa era una delle strade possibili, l'altra strada era quella di disporre degli acidi nucleici, del clonaggio, ecc. E' questa la strada che ha funzionato molto velocemente. L'altra possibilità non ha funzionato perché all'epoca avevamo un sistema di produzione che non era sufficientemente vigoroso. Non avevamo sufficienti particelle prodotte per purificare e caratterizzare le proteine virali. Non lo si poteva fare. All'epoca non si poteva produrre molto virus perché questo virus non compariva nella linea cellulare immortale. Siamo riusciti a farlo col virus LAI [HIV], ma all'epoca non lo sapevamo.    22

D.T.: Ma Gallo è riuscito?

L.M.: Gallo?... Non lo so se lui ha veramente purificato, non lo credo affatto. Credo che si sia buttato molto velocemente sul campo molecolare, cioè, il clonaggio. Ciò che difatti ha eseguito è il Western Blot. Mentre invece noi abbiamo adoperato la tecnica RIPA, quindi ciò che il gruppo americano ha fatto ed era qualcosa di nuovo è stata l’identificazione di alcune proteine che non erano state osservate bene con l'altra tecnica. Qui abbiamo un altro aspetto della caratterizzazione di un virus. Non lo si può purificare, ma se si conosce qualche individuo che ha anticorpi contro le proteine del virus, si può purificare il complesso anticorpo/antigene. E' ciò che abbiamo fatto. Di conseguenza avevamo una banda visibile, etichettata a livello radioattivo, con elementi che sono stati chiamati proteine 25, p25. Anche Gallo ne ha viste delle altre. C'era la p25 che lui chiamò p24, c'era la p41 che noi avevamo visto...            23

D.T.: Per quanto riguarda gli anticorpi, numerose ricerche hanno dimostrato che questi anticorpi reagiscono con altre proteine o elementi che non fanno parte dell'HIV, e che non possono essere ritenuti sufficienti per caratterizzare le proteine dell'HIV.

L.M.: No! Perché avevamo gruppi di controllo. Avevamo della gente che non aveva l'AIDS e che non presentava anticorpi contro queste proteine. Inoltre le tecniche che abbiamo adoperato erano le stesse che io stesso avevo affinato alcuni anni prima per trovare il gene src. Lo sa che anche il gene src è stato trovato tramite l'immunoprecipitazione. Era la p60 (proteina 60). Sono stato molto abile, e anche il mio assistente, nel adoperare la tecnica RIPA. Se si ottiene una reazione specifica, è specifica.      24

D.T.: Ma sappiamo che i pazienti con l’AIDS vengono infettati da altri molteplici agenti infettivi che sono suscettibili di...

L.M.: Beh, sì, comunque gli anticorpi sono molto specifici. Sanno come distinguere una molecola su un milione. C'è una grossa affinità. Quando gli anticorpi hanno sufficiente affinità, si ottiene qualcosa di veramente molto specifico. Con l'ausilio degli anticorpi monoclonali si riesce veramente a ottenere UNA proteina. Tutto ciò viene adoperato per trovare antigeni a scopi diagnostici.  25

D.T.: Secondo Lei la p41 non era di origine virale e perciò non apparteneva all'HIV. Secondo Gallo si trattava della proteina dell'HIV più specifica. Mi potrebbe spiegare il motivo di questa contraddizione?

L.M.: Tutte e due avevamo abbastanza ragione. Ciò vuol dire che avevo ragione nell’impiegare la mia tecnica RIPA ... difatti ci sono proteine cellulari che si trovano ovunque, c'è un "rumore di fondo" non specifico, e tra queste proteine l’actina è molto abbondante nelle cellule. Questa proteina ha un peso molecolare di 43.000kd. Quindi, era lì. Quindi io avevo abbastanza ragione, ma ciò che Gallo ha visto, dall'altra parte, era la gp41 dell’HIV, perché lui impiegava il Western Blot, e lo ho riconosciuto.           26

D.T.: Secondo Lei la p24 era la proteina più specifica dell'HIV, ma secondo Gallo non lo era in assoluto. Si capisce grazie ad altri studi che gli anticorpi indirizzati verso la p24 spesso venivano trovati nei pazienti che non erano stati infettati dall'HIV, e anche in certi animali. Infatti, oggigiorno una reazione anticorpale indirizzata contro la p24 viene considerata non specifica.

L.M.: Non è sufficiente per diagnosticare l'infezione da HIV.     27

D.T.: Nessuna proteina è sufficiente?

L.M.: Ad ogni modo una proteina non è sufficiente. Tuttavia, all'epoca il problema non si aveva rivelato così. Il problema consisteva nel conoscere se si trattava di un HTLV o no. L'unico retrovirus umano conosciuto era l'HTLV. Abbiamo dimostrato chiaramente che non si trattava di un HTLV, che gli anticorpi monoclonali di Gallo contro la p24 dell'HTLV non riconoscevano la p25 dell'HIV.      28

D.T.: Alla densità dei retrovirus, cioè 1,16, ci sono molte particelle, ma soltanto il 20% di codeste appartiene all'HIV. Perché l'80% delle proteine non sono virali mentre le altre lo sono? Come si fa a distinguerle?

L.M.: Ci sono due spiegazioni. Da una parte, a questa densità abbiamo elementi che vengono chiamati microvescicole di origine cellulare, che hanno la stessa misura circa dei virus, e poi lo stesso virus, nella fase di gemmazione, porta proteine cellulari. Quindi difatto queste proteine non sono virali, ma di origine cellulare. Quindi, come si fa per distinguerle? Onestamente, con questa tecnica non lo si può fare con precisione. Ciò che possiamo fare è purificare il virus fino al massimo con gradienti successivi, e sempre ci imbattiamo sulle stesse proteine.       29

D.T.: Ma le altre spariscono?

L.M.: Diciamo che le altre si riducono un po’. Le microvescicole vengono eliminate, ma ogni volta si perde una buona parte del virus, quindi bisogna avere una buona quantità del virus per iniziare affinché se ne possa conservare un po’ quando si giunge alla fine. Poi un’altra volta è l'analisi molecolare, è infatti la sequenza di queste proteine ciò che ci consentirà di affermare se sono di origine virale o no. Questo è quello che abbiamo cominciato a fare per quanto riguarda la p25, che poi fallì... e l'altra tecnica consiste nel fare il clonaggio, e quindi dopo si ottiene il DNA e dal DNA si ottengono a loro volta le proteine. In seguito si deduce la sequenza delle proteine, la loro misura e ci si imbatte un’altra volta su quello che avevamo già osservato per quanto riguarda l’immunoprecipitazione e l'elettroforesi su gel. Conoscendo le misure delle proteine degli altri retrovirus, si possono dedurre queste proteine alquanto accuratamente per analogia. Quindi abbiamo la p25 che è vicina alla p24 dell’HTLV, abbiamo la p18... alla fine abbiamo le altre. Dall'altra parte, la proteina che era molto differente era la grossissima p120.    30

D.T.: Oggi sono stati risolti i problemi relativi alla produzione in serie del virus, la purificazione, le micrografie EM alla banda di 1,16?

L.M.: Sì, certo.   31

D.T.: Esistono micrografie EM dell’HIV provenienti dalla purificazione?

L.M.: Sì, certo.   32

D.T.: Sono state pubblicate?

L.M.: Non saprei risponderle... ne abbiamo qualcuna da qualche parte... ma non interessano minimamente.     33

D.T.: Oggigiorno, mediante la produzione in serie dei virus, è possibile, dopo l’avvenuta  purificazione, vedere una EM di un gran numero di virus?

L.M.: Certo, certo, esattamente. Si possono vedere, si possono anche vedere delle bande visibili.    34

D.T.: Quindi secondo Lei l'HIV esiste?

L.M.: Beh, è chiaro. L’ho visto e l’ho incontrato.   35