ENTREVISTA A LUC MONTAGNIER

LUC MONTAGNIER REALMENTE DESCUBRIÓ EL VIH?

Por Djamel Tahi

 “¡Lo repito, no lo hemos aislado!”

Revista Continuum vol 5, número 2, edición de otoño de 1997

Texto de una entrevista grabada en video que se llevó a cabo en el Instituto Pasteur en Julio de 1997. Las respuestas de Luc Montagnier están numeradas para facilitar la referencia al análisis de Papadopulos-Eleopulos y cols. en su respuesta.

 

D.T.: Un grupo de científicos de Australia arguyen que hasta ahora nadie aisló el virus del SIDA, el VIH. Según ellos no se han respetado minuciosamente las normas para el aislamiento de los retrovirus en lo que se refiere al VIH. Estas normas son: cultivo en vitro, purificación del material mediante ultra centrifugación, micrografías al microscopio electrónico (EM) del material que bandea a la densidad de los retrovirus, caracterización de estas partículas y prueba de la capacidad infectiva de las partículas.

L.M.: No, eso no es aislamiento. Hemos aislado porque hemos “transmitido” el virus, hicimos un cultivo del virus. Por ejemplo, Gallo dijo: “Ellos no aislaron el virus... y nosotros (Gallo y cols.), lo hicimos emerger en abundancia en una línea celular inmortal”. Pero antes de hacerlo emerger en líneas celulares inmortales, lo hicimos emerger en cultivos de linfocitos normales procedentes de un donante de sangre. Ese es el criterio principal. Teníamos  algo que se podía transmitir en serie, que se podía conservar. Y había sido caracterizado como un retrovirus no sólo por sus propiedades visibles, si no que también por las propiedades bioquímicas, es decir, la actividad de RT [trancriptasa inversa], que es realmente especifica de los retrovirus. También tuvimos reacciones de los anticuerpos contra algunas proteínas, que probablemente eran proteínas internas. Digo probablemente por analogía con el conocimiento de otros retrovirus. Es obvio que no habríamos podido aislar este retrovirus sin contar con el conocimiento de otros retrovirus. Pero creo que hemos cumplido con los criterios de aislamiento, completamente.       1

D.T: Volvamos a las normas de aislamiento de los retrovirus que son: cultivo en vitro, purificación a la densidad de los retrovirus, micrografías EM del material a la densidad de los retrovirus, caracterización de las partículas, prueba de la capacidad infectiva de las partículas. ¿Se dieron todos estos pasos para el aislamiento del VIH? Querría añadir que de acuerdo con diversas referencias de artículos científicos publicados y que fueron mencionados por el grupo de investigación australiano, la RT no es específica de los retrovirus. Además, ¿Es cierto que vuestro trabajo para detectar la RT no fue realizado en el material purificado?

L.M.: Creo que publicamos en Science (en Mayo de 1983) un gradiente que mostraba que la RT tenía exactamente una densidad de 1,16. Por lo tanto se tenía un máximo, que era RT. Por lo tanto se había cumplido este criterio para la purificación. Pero es difícil transmitirlo en serie porque cuando se coloca el material que se está por purificar en un gradiente, hay que saber que los retrovirus son muy frágiles, y por lo tanto se rompen unos a otros perdiendo enormemente su poder infeccioso. Pero aun así, pienso que conseguimos mantener un poco de su poder infeccioso. Sin embargo, en ese entonces no era tan fácil como lo es ahora, porque las cantidades de virus eran muy bajas. Al principio tropezamos con un virus que no mataba las células. El virus procedía de un paciente asintomático y por lo tanto fue clasificado entre los virus que no forman sincitios y no cito patogénicos que emplean el co-receptor ccr5. Fue el primer virus [del homosexual llamado] BRU. Teníamos muy poca cantidad de ese virus, y no se lo podía transmitir a una línea de células inmortal. Tratamos de hacerlo durante varios meses, pero no lo logramos. Mientras que con la segunda cepa lo hemos logrado muy fácilmente. Sin embargo allí reside el problema bastante misterioso de la contaminación de aquella segunda cepa por obra de la primera. A eso se lo llamó LAI [VIH].      2

D.T.: ¿Por qué las micrografías EM que ustedes publicaron proceden de un cultivo celular in vitro y no del material purificado?

L.M.: Había tan poca producción de virus que era imposible ver lo que podía haber en un concentrado de virus procedente de un gradiente. No había una cantidad suficiente de virus para hacerlo. Por supuesto que lo hemos buscado, pero aunque lo buscábamos desde el principio en los tejidos y también en la biopsia, vimos algunas partículas pero no presentaban la morfología típica de los retrovirus. Eran muy diferentes, relativamente diferentes. Por lo tanto nos llevó varias horas encontrar las primeras micrografías en el cultivo in vitro. Fue un esfuerzo gigantesco! Es fácil criticar todo esto posteriormente. Lo que no teníamos, y siempre lo reconocí, es la confirmación de que fuese la verdadera causa del SIDA o no.      3

D.T.: ¿Cómo es posible, sin tener a disposición micrografías al microscopio electrónico (EM) de la purificación, saber que estas partículas son virales y que pertenecen a un retrovirus, incluso que pertenecen a un retrovirus específico?

L.M.: Pues, había micrografías de la gemación. Publicamos imágenes de la gemación, que son características de los retrovirus. Dicho esto, no se podía afirmar que realmente se tratase de un retrovirus sólo basándose en la morfología. Por ejemplo, un experto francés en micrografías EM de retrovirus me atacó públicamente diciendo: “Este no es un retrovirus, es un arenavirus”. Porque existen otras familias de virus que también geman de la membrana celular y que tienen puntas en su superficie, etc.      4

D.T.: ¿Por qué existe esta confusión? Las micrografías EM no muestran claramente un retrovirus?

L.M.: En ese momento los retrovirus mejor conocidos eran los de tipo C, que eran muy típicos. El retrovirus del que estamos hablando no era del tipo C y los lentivirus eran poco conocidos. Personalmente lo reconocí en la biblioteca, mirando micrografías del virus de la anemia infecciosa equina, y después las del virus visna. Pero repito, no fue sólo la morfología y la gemación, existía RT... fue el conjunto de estas propiedades lo que me hizo decir que se trataba de un retrovirus.      5

D.T.: Respecto la RT, se la detecta en el cultivo in vitro. Entonces si se encuentran partículas retrovirales significa que se ha purificado. Sin embargo, a esta densidad existen muchos otros elementos, entre otros aquellos que se denominan “similares a los virus”.

L.M.: Exactamente, exactamente. Es decir, no es solamente una propiedad sino el conjunto de las propiedades lo que nos hizo afirmar que se trataba de un retrovirus que pertenece a la familia de los lentivirus. Tomada aisladamente, cada una de las propiedades no es realmente específica, lo que cuenta es el conjunto de las propiedades. Por lo tanto teníamos el gradiente de densidad, la RT, las micrografías de la gemación y la analogía con el virus visna. Esas son las cuatro características.      6

D.T.: ¿Pero como demuestran todos estos elementos que se trata de un nuevo retrovirus? Algunos de estos elementos podrían pertenecer a otras cosas, como a  partículas “semejantes a virus” por ejemplo...?

L.M.: Sí, e inclusive tenemos retrovirus endógenos que a veces expresan partículas, pero que son de origen endógeno y que por lo tanto no tienen un rol patológico, de todos modos no en el SIDA.       7

D.T.: ¿Pero entonces como se puede distinguir la diferencia?

L.M.: Porque logramos “transmitir” el virus. Transmitimos la actividad RT a nuevos linfocitos. Obtuvimos un máximo de replicación. Seguimos las huellas del virus. Es el conjunto de las propiedades lo que nos hizo afirmar que era un retrovirus. ¿Y por qué es nuevo? La primera pregunta que nos hizo la revista Nature fue: “¿No es una contaminación de laboratorio? ¿Se trata tal vez de un retrovirus de un ratón o de un retrovirus animal?”. ¡A ello podíamos decir que no! Porque habíamos demostrado que el paciente tenía anticuerpos contra una proteína de su propio virus. ¡El conjunto tiene una lógica perfecta! Pero es importante tomarlo como un conjunto. Si se toma cada propiedad en forma independiente, se ve que no son específicas. Es el conjunto que da la especificidad.      8

D.T.: Sin embargo, ¿Usted observó partículas que parecían retrovirus a la densidad de los retrovirus? ¿Observó un nuevo retrovirus?

L.M.: A una densidad de 1,15, 1,16 tuvimos un máximo de actividad RT, que es la enzima característica de los retrovirus.      9

D.T.: ¿Pero podría haber sido otra cosa?

L.M.: No..., opino que era muy claro [que no se trataba de otra cosa]. Así como era, no habría sido posible que hubiese sido otra cosa que no fuera un retrovirus. Dado que la enzima que F. Barre-Sinoussi caracterizó bioquímicamente requería magnesio, un poco como el HTLV en otro lugar. Requería la matriz, la plantilla, también el primer que era totalmente característico de una RT. No había lugar a dudas. En Septiembre de 1983 en Cold Spring Harbour, Gallo me preguntó si estaba seguro de que era una RT. Lo sabía, pues F. Barre-Sinoussi había hecho los controles necesarios. No se trataba de una simple polimerasa celular, si no que era una RT. Sólo funcionaba con primers de ARN y hacía ADN. Estábamos seguros de eso.      10

D.T.: ¿Usted siguió el mismo procedimiento y encontró las mismas dificultades con los otros retrovirus que encontró a lo largo de su carrera?

L.M.: Yo diría que en lo que se refiere al VIH, es un proceso fácil, comparado con los obstáculos con los que uno se encuentra con los otros [retrovirus]... porque el virus no emerge o inclusive porque el aislamiento es esporádico – uno lo logra una vez de cada cinco tentativas. Estoy hablando de investigación corriente en otras enfermedades. Se puede citar el virus de la esclerosis múltiple del profesor Peron. Hace diez años me mostró su trabajo y le llevó alrededor de diez años encontrar finalmente una secuencia genética que esté  muy cerca de un virus endógeno. Lo ve...es muy difícil. Dado que no logró “transmitir” el virus, no pudo lograr que emergiera en un cultivo in vitro, mientras que el VIH emerge por todos lados como la mala hierba. Es por ese motivo que contaminó a los otros.      11

D.T.: ¿Con qué cultivó Usted los linfocitos de su paciente? ¿Con la línea celular H9?

L.M.: No, porque no funcionó absolutamente con la H9. Usamos muchas líneas celulares y la única que logramos cultivar fue la de los linfocitos Tambon.      12

D.T.: Sin embargo, utilizando este tipo de elementos es posible introducir otras cosas capaces de inducir una RT y proteínas, etc...

L.M.: Concuerdo completamente. Ello fue el motivo por el cual al final no estábamos tan interesados en emplear líneas celulares inmortales. Para cultivar el virus en serie, muy bien. Pero no para caracterizarlo, porque sabíamos que íbamos a introducir otras cosas. Hay líneas celulares MT que fueron encontradas por los japoneses (MT2, MT4) que replican al VIH muy bien y que al mismo tiempo son transformadas por el HTLV. Por lo tanto, se tiene una mezcla de VIH y HTLV. Es una verdadera mezcla.      13

D.T.: Aun mas, ¿No es imposible el hecho que los pacientes estén infectados por otros agentes infecciosos?

L.M.: Podría haber micoplasmas...podría haber muchas cosas. Pero afortunadamente tuvimos una experiencia negativa con los virus relacionados con los tumores y ello nos ayudó, porque ya habíamos tropezado con todos estos problemas. Por ejemplo, un día tuve un máximo de RT muy débil que F. Barre-Sinoussi me dio con una densidad un poco más alta, de 1,19. ¡Yo la controlé! Era un micoplasma, no un retrovirus.      1

D.T.: Con el material purificado a la densidad de los retrovirus, ¿Cómo es posible distinguir entre lo que es viral y lo que no lo es? Porque a esta densidad hay muchas cosas, incluso partículas “semejantes a  virus”, fragmentos celulares...

L.M.: Sí, es por ello que es más fácil trabajar con el cultivo celular porque se ven las fases de producción de virus. Se tiene la gemación. Charles Dauget (un experto en EM) más bien observó las células. Por supuesto que miró el plasma, el concentrado, etc... pero no vio nada importante. Dado que si se hace un concentrado es necesario obtener una sección ultra fina [para ver un virus con el EM], y para obtener una sección ultra fina es necesario tener un concentrado que mida por lo menos como la cabeza de una aguja. Por lo tanto se necesitan cantidades enormes de virus. Sin embargo, se obtienen muy fácilmente secciones ultra finas de células y en estas secciones es donde Charles Dauget encontró el retrovirus en diferentes fases de gemación.     15

D.T.: Cuando se observan las micrografías al microscopio electronico que fueron publicadas, a Usted, que es un retrovirólogo, ¿Le resulta claro que es un retrovirus, un nuevo retrovirus?

L.M.: No, llegados a ese punto no se puede afirmar. Las primeras micrografías de la gemación podían referirse a un tipo de virus C, pero no se puede distinguir.      16

D.T.: ¿Podría ser otra cosa que no sea un retrovirus?

L.M.: No...pues, después de todo, sí...podría ser otro virus en gemación. Pero existe un...tenemos un atlas. La experiencia es lo que nos hace entender lo que es un retrovirus y lo que no lo es. Se puede distinguir de acuerdo a la morfología, pero hay que tener una cierta experiencia.      17

D.T.: ¿Por qué no emplear la purificación para hacer tal distinción?

L.M.: Repito que no purificamos. Purificamos para caracterizar la densidad de la RT, que era sólidamente la de un retrovirus. Pero no llegamos al máximo... o no funcionó...porque si se purifica, se daña. Por lo tanto respecto a las partículas infecciosas, es mejor no tocarlas mucho. Por lo tanto simplemente se toma el sobrenadante del cultivo de linfocitos que ha producido el virus y se lo coloca en pequeña cantidades en algunos nuevos cultivos de linfocitos. Y por consiguiente, se transmite el retrovirus en serie y siempre se obtendrán las mismas características, aumentando la producción cada vez que se lo transmite.      18

D.T.: ¿Por lo tanto la fase de purificación no es necesaria?

L.M.: No, no, no es necesaria. Lo que es esencial es transmitir el virus. El problema que tuvo Peron con el virus de la esclerosis múltiple fue debido al hecho que él no lograba transmitir el virus de un cultivo in vitro al otro. Éste es el problema. Logró hacerlo pero muy poco, pero no fue suficiente para caracterizarlo. Y hoy en día caracterizar significa sobre todo hacerlo a nivel molecular. Si se desea, el procedimiento puede ser realizado más rápidamente. Por lo tanto para hacerlo se necesita comenzar con una secuencia de ADN, clonar este ADN, amplificarlo, secuenciarlo, etc...Entonces tenemos ADN, la secuencia del ADN que nos dice si es realmente un retrovirus. Se conoce la estructura típica de los retrovirus, todos los retrovirus tienen una estructura genómica típica relacionada con un gen tal que es característico.      1

D.T.: ¿Por lo tanto la fase de purificación no es obligatoria para el aislamiento de retrovirus? ¿Se pueden aislar retrovirus sin purificar?

L.M.: Sí...no es obligatorio transmitir material puro. Sería mejor, pero existe el problema de que se lo daña y que disminuye la propiedad infecciosa de los retrovirus.      20

D.T.: ¿Sin pasar a través de esta fase de purificación, no existe el riesgo de confundir las proteínas que se identifican y también la RT, que podría proceder de otra cosa?

L.M.: No... después de todo, repito que si tenemos un máximo de actividad RT a la densidad de 1,15, 1,16 existen 999 posibilidades en 1.000 de que sea un retrovirus. Pero podría ser un retrovirus de origen diferente. Repito, existen algunos retrovirus endógenos, es decir, pseudo partículas que pueden ser emitidas por las células, pero aun así, proceden de la zona del genoma que proporciona los retrovirus. Los retrovirus endógenos se heredan y permanecen en la célula durante muchísimo tiempo. Pero finalmente, para obtener la prueba – porque las cosas evolucionan como la biología molecular permitiendo una caracterización aun más fácil – es necesario pasar muy rápidamente a la clonación. Y tanto Gallo como nosotros mismos lo hicimos muy rápidamente. Clonación y secuenciación, es allí donde se tiene la caracterización completa. Pero repito, la primera caracterización es la pertenencia a la familia de los lentivirus, la densidad, la gemación, etc... las propiedades biológicas, la relación con las células T4. Todas estas cosas forman parte de la caracterización, y fuimos nosotros los que la llevamos a cabo.      21

D.T.: ¿Pero se llega a un punto donde se debe llevar a cabo la caracterización del virus. Esto significa: ¿Cuales son las proteínas que lo componen?

L.M.: Eso es. Entonces el análisis de las proteínas del virus requiere producción en serie y purificación. Hay que hacerlo. Pero es aquí donde yo debería decir que hubo un fracaso parcial. J. C. Chermann estaba a cargo de hacer esto, al menos en lo que respecta a las proteínas internas, pero tuvo dificultades en producir el virus y no funcionó. Pero este era uno de los modos posibles, el otro modo era el de tener ácido nucleico, clonación, etc. Esta es la manera en que funcionó muy rápidamente. La otra posibilidad no funcionó porque en ese momento teníamos un sistema de producción que no era suficientemente sólido. No teníamos suficientes partículas producidas para purificar y caracterizar las proteínas virales. No se podía hacerlo. En ese momento no se podía producir mucho virus porque este virus no emergía en la línea celular inmortal. Lo logramos con el virus LAI [HIV], pero en ese momento no lo sabíamos.      22

D.T.: ¿Y  Gallo lo logró?

L.M.: Gallo?... No se si realmente purificó, no lo creo. Creo que se lanzó muy rápidamente en el campo molecular, es decir, en la clonación. Lo que sí hizo es el Western Blot. Mientras nosotros usamos la técnica RIPA, entonces lo que el grupo norteamericano hizo y que era nuevo fue identificar algunas proteínas que no habían sido vistas bien con la otra técnica. Aquí tenemos otro aspecto de la caracterización de un virus. No se lo puede purificar, pero si se conoce a alguien que tiene anticuerpos contra las proteínas del virus, se puede purificar el complejo anticuerpo/antígeno. Es lo que se hizo. Y por lo tanto se tenía una banda visible, clasificada a nivel radiactivo, con elementos que han sido llamados proteínas 25, p25. Y Gallo vio otras. Estaba la p25 que él denominó p24, estaba la p41 que nosotros vimos...      23

D.T.: Con respecto a los anticuerpos, numerosos estudios demostraron que estos anticuerpos reaccionan con otras proteínas o elementos que no son parte del VIH, y que no pueden ser considerados suficientes para caracterizar las proteínas del VIH.

L.M.: ¡No! Porque teníamos grupos de control. Teníamos individuos que no tenían SIDA y que no tenían anticuerpos contra esas proteínas. Además, las técnicas que empleamos eran técnicas que yo mismo refiné algunos años antes para detectar el gen src. Sabe que también el gen src fue detectado mediante la inmunoprecipitación. Era la p60 (proteína 60). Fui muy hábil, y también mi asistente, en utilizar la técnica RIPA. Si se obtiene una reacción específica, es específica.      24

D.T.: Pero sabemos que los pacientes con SIDA están infectados por muchos otros agentes infecciosos que son susceptibles de...

L.M.: Ah sí, pero los anticuerpos son muy específicos. Saben como distinguir una molécula en un millón. Existe una grandísima afinidad. Cuando los anticuerpos tienen una afinidad suficiente, se obtiene algo realmente muy específico. Mediante los anticuerpos monoclonales se obtiene realmente UNA proteína. Todo ello se emplea para detectar antígenos con fines diagnósticos.      25

D.T.: Según su parecer la p41no era de origen viral y por lo tanto no pertenecía al VIH. Para Gallo era la proteína del VIH más específica. ¿Me puede explicar el motivo de esta contradicción?

L.M.: Ambos teníamos bastante razón. Es decir, yo tenía razón en utilizar mi técnica RIPA... en efecto, hay proteínas celulares que se encuentran en todos lados, - hay un “ruido de fondo” no especifico, y entre estas proteínas una es muy abundante en las células, la actina. Esta proteína tiene un peso molecular de 43.000kd. Por lo tanto, estaba allí. Entonces yo tenía bastante razón, pero por otra parte, lo que Gallo vio era la gp41 del VIH, porque el estaba empleando el Western Blot, y yo eso lo reconocí.      26

D.T.: Según su parecer la p24 era la proteína más específica del VIH, pero según Gallo no lo era absolutamente. Se comprende gracias a otros estudios que a los anticuerpos dirigidos contra la p24 frecuentemente se los encontraba en pacientes que no estaban infectados por el VIH, e incluso en algunos animales. De hecho, hoy en día una reacción de anticuerpos contra la p24 se la considera no específica.

L.M.: No es suficiente para diagnosticar la infección del VIH.      27

D.T.: ¿Ninguna proteína es suficiente?

L.M.: De todos modos una proteína no es suficiente. Pero en ese momento el problema no se reveló así. El problema era el de saber si era un HTLV o no. El único retrovirus humano conocido era el HTLV. Y demostramos claramente que no era un HTLV, que los anticuerpos monoclonales de Gallo contra la p24 del HTLV no reconocían la p25 del VIH.      28

D.T.: A la densidad de los retrovirus, 1,16, hay muchas partículas, pero sólo un 20% de ellas pertenecen al VIH. ¿Por que el 80% de las proteínas no son virales y las otras lo son? ¿Cómo se hace para distinguirlas?

L.M.: Hay dos explicaciones. Por un lado, a esta densidad se tienen elementos a los que se los denomina microvesículas de origen celular, que tienen aproximadamente el mismo tamaño de los virus, y después el virus mismo, en gemación, trae consigo proteínas celulares. Por lo tanto de hecho estas proteínas no son virales, si no que son de origen celular. Entonces, ¿Cómo se las puede distinguir? Honestamente, con esta técnica no se lo puede hacer con precisión. Lo que se puede hacer es purificar el virus hasta el máximo con gradientes sucesivos, y siempre nos tropezamos con las mismas proteínas.      29

D.T.: ¿Las otras proteínas desaparecen?

L.M.: Digamos que las otras se reducen un poco. Se eliminan las microvesículas, pero cada vez se pierde mucho virus, por lo que se necesita contar al comienzo con una buena cantidad de virus para conservar un poco de éste cuando se llega al fin.  Y después otra vez es el análisis molecular, la secuencia de esas proteínas lo que permitirá decir si son de origen viral o no. Esto es lo que comenzamos a hacer con respecto a la p25, que fracasó ...y la otra técnica es realizar la clonación, y por lo tanto después se obtiene el ADN y del ADN a su vez se obtienen las proteínas. Se deduce la secuencia de las proteínas, su tamaño y se tropieza otra vez con lo que se había observado en la inmunoprecipitación y en la electroforesis por gel. Conociendo el tamaño de las proteínas de los otros retrovirus, estas proteínas se pueden deducir bastante a fondo por analogía. Por lo tanto tenemos la p25 que estaba muy cerca de la p24 del HTLV, tenemos la p18... al final tenemos las otras. Por otra parte, la proteína que era muy diferente era la proteína p120, que es enorme.      30

D.T.: ¿Hoy se resolvieron los problemas relacionados con la producción en masa del virus, purificación, micrografías EM en la banda de densidad 1,16?

L.M.: Sí, por supuesto.      31

D.T.: ¿Existen micrografías EM del VIH procedentes de la purificación?

L.M.: Si, por supuesto.      32

D.T.: ¿Fueron publicadas?

L.M.: No sabría decirle... tenemos algunas en algún lugar...pero no interesan, no interesan en lo mas mínimo.      33

D.T.: Actualmente, mediante la producción en serie de los virus, ¿Es posible ver una EM, después de la purificación, de un gran numero de virus?

L.M.: Sí, sí, desde luego.

D.T.: Por lo tanto según su parecer ¿El VIH existe?

L.M.: Oh, claro. Lo he visto y lo he encontrado.      35